Erreportajeak

2016ko martxoa
CRISPR/Cas teknologia: biologia molekularraren iraultza berria

Jenniffer Doudna eta Emmanuelle Charpentier ikertzaileen izenak bolo-bolo ditugu han-hemenka. 2015ean Breakthrough Saria eta Asturiaseko Printzesaren Saria jaso zuten, besteak beste. Hain da handia zientzilari hauen sona, Time aldizkariak urtero kaleratzen duen munduko 100 lagun entzutetsuenen zerrendan sartu dituela eta munduko handikiek Doudna gonbidatu egin zutela Davosen (Suitza) urtero ospatzen duten Munduko Ekonomia Forora. Nobel Sarirako kinieletan ere badago euren izena. Zein da, ordea, ikertzaile hauen inguruan sortu den ikusminaren sorburua? Galdera horren erantzun laburra honakoa da: CRISPR/Cas.

CRISPR/Cas teknologia: biologia molekularraren iraultza berria
Egilea: Mikel Irastortza

Mikel Irastortza (Irun, 1987) mikrobiologia molekularrean doktoretza-tesia egiten ari da eta bakterioen zelula-antolamendua eta polaritatea ditu aztergai.

Baina, zer da CRISPR/Cas?

CRISPR (ingeleseko Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeat) sekuentziak zenbait bakterio eta arkeoen genometako DNA sekuentzia bitxi batzuk dira. CRISPR sekuentzien berri 90.eko hamarkadan izan genuen lehen aldiz. Santa Polako (Alacant, Herrialde Katalanak) gatzagetan bizi den Haloferax mediterranei arkeobakterioaren biologia ikertzen zuen orduan Francisco Mojica doktoregaiak. Arkeobakterio horren genomari so egitean oso interesgarri egin zitzaizkion sekuentzia batzuk aurkitu zituen, gerora CRISPR gisa ezagutuko zirenak (1).

CRISPR sekuentziak 30 nukleotidoko sekuentzia errepikakor eta palindromikoak dira, ezker-eskuin ala harazpi osagarrian eskuin-ezker berdin irakurtzen direnak. CRISPR sekuentzia horiek genomako eskualde jakin batean pilatzen dira array edota sekuentzia-bilduma bat osatuaz, eta errepikapen bakoitzaren ondoren 36 nukleotido inguruko sekuentzia tartekatzaile (edo spacer) bat luzatzen da hurrengo CRISPR errepikapeneraino. CRISPR arrayak, beraz, CRISPR-spacer1-CRISPR-spacer2- … gisako antolamendua du (1. Irudia). Mojicak izan zuen 1987an lantalde japoniar batek kaleratutako artikulu baten berri zeinetan Escherichia coli bakterioan sekuentzia berezi batzuk deskribatzen ziren, egituraren ikuspuntutik antzekoak berak H. mediterranei arkeobakterioan aurkitu zituenekiko (2). Talde japoniarrak ez zion hariari gehiago tira egin. Mojicak, aldiz, CRISPR sekuentzia bitxi horiek ikertzeari ekin zion, E. coli eta H. mediterranei bezalako bi ahaide hurrunetan egonagatik zinez funtzio garrantzitsua bete behar zutelakoan.

Urteen poderioz eta sekuentziazio teknologiek aurrera egin ahala CRISPR sekuentziak zituzten espezieen katalogoa luzatuz joan zen. 2005 urtean Mojicak CRISPR sekuentzien ikerketari berebiziko interesa emango zion aurkikuntza egin zuen. Konturatu zen CRISPR sekuentzia errepikakorren artean tartekatzen diren spacer horietako zenbait oso antzekoak zirela bakterioak eta arkeoak erasotzen dituzten birusen (edo fagoen) genomen sekuentziekiko. Proposatu zuen spacer horiek mikrobioek iraganean pairatutako infekzio birikoen inpronta zirela eta funtzionatzen zutela oroimen immunologiko gisa. Beste hitzetan esanda, mikroorganismoentzat CRISPR sekuentzietako spacer horiek infekzio birikoen eta bestelako DNA arrotzen aurkako txerto gisa joka zezaketela hipotetizatu zuen (3).

Mojicaren hipotesiak erakarrita CRISPR sekuentziengan jarri zuen arreta hainbat ikertzailek, eta 2006an frogatu zen baietz, spacer horiek immunitatea ematen zietela mikroorganismoei preseski spacer horiekiko homologoak ziren fagoen eta plasmidoen aurrean (4). Urteen poderioz argituz joan zen spacer berriak nola txertatzen diren mikroorganismoaren genoman eta, are garrantzitsuago, zein mekanismoren bidez funtzionatzen duen CRISPR sekuentziek kodetutako immunitate-sistemak.

1. Irudia: Streptococcus thermophilus bakterioaren CRISPR locusa. CRISPR sekuentziak (erronbo beltzak) eta hainbat spacer (koloretako laukizuzentxoak) ageri dira. Cas geneak eta tracrRNA transkribatzen duen DNA sekuentzia ere ageri dira. Iturria: (5)

Sistemak funtzionatzeko beharrezko dira genoman CRISPR klusterren ondoan kokatzen diren cas (ingeleseko CRISPR-associated) gene batzuk. cas gene horietako batek DNAren bi harizpiak ebakitzen dituen proteina (endonukleasa) bat kodetzen du. Mikroorganismora fago baten infekzioz edota plasmido baten konjugazioz sartu den DNA arrotza CRISPR klusterreko spacer batekiko homologoa baldin bada, Cas endonukleasa horrek ebaki egingo du. Hartara, mikroorganismoa birusaren edota bestelako DNA arrotzen inbasiotik salbu izango da. Nola daki Cas endonukleasak, ordea, DNA arrotz hori ebaki behar duela eta non eman ebakia? Bada, spacer bakoitzari dagozkion sekuentziak transkribatu egiten dira CRISPR-RNA (crRNA) gisa. crRNA hori CRISPR klusterraren hasierako sekuentzia batetik transkribatzen den beste tracrRNA (ingeleseko trans acting crRNA) molekula batekin parekatzen da, crRNA-tracrRNA duplexa osatuaz. Duplexa Cas9 endonukleasara lotzen da eta,  crRNAk DNA arrotzarekiko duen osagarritasunagatik, crRNA-tracrRNA duplexak Cas endonukleasa DNA harizpi bikoitza zehazki ebaki behar den puntura eramaten du (2. Irudia). Laburbilduz, esan daiteke Cas9 crRNAk zehatz-mehatz bideratzen duen endonukleasa espezifikoa dela.

 

2. Irudia: Streptococcus pyogenes bakterioaren CRISPR/Cas9 sistema. crRNA-tracrRNA duplexak Cas9 ebaketa zehazki egin beharko den puntura eramaten du, crRNAak berak ebaki beharreko DNArekiko duen osagarritasunagatik. Cas9 PAM (ingelesezko Proto-spacer Adjacent Motif) sekuentzia batera ainguratuko da DNAren harizpi bakoitzean ebaketa bana egiteko (beltzez). Iturria: (6)

 CRISPR/Cas9: genomak nahieran editatzeko giltza

2012an Doudna eta Charpentieren lantaldeek Science aldizkarian elkarlanean kaleratutako artikulu batean deskribatu zuten Streptococcus pyogenes bakterioan oinarritutako CRISPR/Cas sistema bat (7). crRNA eta tracrRNA molekula kimeriko bakar gisa konbinatu zituzten, sgRNA (ingeleseko single guide RNA). Frogatu zuten Cas9 endonukleasa gai dela edozein DNA zehazki ebakitzeko sgRNA molekulak adierazten dion puntuan eta ingeniaritza genetiko apur batez sgRNA hori nahieran eraldatuz gero Cas9 endonukleasa bestelako DNA sekuentzietara bideratu zitekeela. Funtsean, RNA bidez gidatutako DNA endonukleasa zehatz eta programagarri baten berri eman zuten (3. Irudia).

3. Irudia: Doudna eta Charpentierren lantaldeek argitaratutako CRISPR/Cas9 sistema (7). S. pyogenes bakterioren CRISPR/Cas9 sisteman oinarriturik, crRNA (gorriz) eta tracrRNA (beltzez) linker baten bidez lotu zituzten eta, hala, Cas9 endonukleasa sgRNA molekula bakar baten bidez programa daiteke. Iturria: (6).

CRISPR/Cas9 sistema honen aplikazioak itzelak dira eta azkar zabaldu da komunitate zientifikoan teknologia honen berri. Oroz gain, oinarrizko ikerketan urrea balio duen genomen ediziorako atea ireki du teknologia honek. Cas9 endonukleasarekin DNA genomikoa ebaki ondoren, zelularen helburua izaten da ebaki hori lehenbailehen konpontzea. Zelulak baditu horretarako hainbat mekanismo, baina kanpotik ebaki puntu horretara egokitutako DNA txertatzen bazaio, zelulak DNA kanpotar hori ere erabil dezake ebakia konpontzeko. Ikertzaileak zelulari amarrua egin diezaioke, ordea. Kanpotik txertatutako DNA horrek zientzilariak aurretiaz prestatutako mutazio bat eraman dezake eta hala, ebakia konpontzearen larritasunagatik zelulak itsu-itsuan mutazio hori bere genomara gehituko du (ikusi bideoa). Mutazioa genomara gehitzen bada, DNA genomikoak ez du jadanik crRNArekiko erabateko osagarritasunik izango eta Cas9 endonukleasak ez du gehiago ebakiko DNA hori. Zelula biziraun egingo du horrela eta ikertzaileak jakingo du, printzipioz, esperimentutik bizirik irteten diren zelulek berak nahi duen mutazioa daramatela

2013 urtean argitaratu ziren CRISPR/Cas9 sistemaren bidez egindako lehen giza genomen edizioak (810). Denbora gutxian ugaztun, intsektu, onddo, bakterio, protozoo eta bestelako zeluletan funtzionatzeko egokitu diren hamarnaka sistema kaleratu dira eta mundu osoko laborategiak hasiak dira jadanik teknika hau genomen edizioan erabiltzen. Genomen edizioak ikerkuntzan izan ditzakeen erabilerak zinez interesgarriak dira: geneen funtzioa iker daiteke geneetan DNA sekuentziak gehitu/kendu/eraldatuaz, proteinen ikerketan sakondu daiteke etiketak kodetzen dituzten sekuentziak txertatuaz, promotoreak mutatu daitezke gene espresioa aztertzeko, organismo transgenikoak sor litezke …

Zalantza etikoak ere sortu dira teknologia iraultzaile honen eta bere aplikazioen inguruan. Alarma gorria piztu zen 2015eko apirilean Junjiu Huang ikertzailearen lantaldeak (Sun Yat-sen Unibertsitatea, Guangzhou, Txina) argitaratu zuenean CRISPR/Cas teknologiaren bidez giza enbrioien zelulak modifikatu zituztela (11). Horren harira, hainbat adituk, Doudnak berak tarteko, agiri bat kaleratu zuten CRISPR/Cas9 teknologiaren bidezko giza genomen edizioaren inguruan eztabaida sustatzeko (12, 13). “Kontuan harturik giza genomen edizioaren teknologia zein azkar ari den garatzen, beharrezkoa ikusten dugu zientzialarien, osagileen, soziologoen, erakunde publikoen eta gizartearen beraren arteko eztabaida irekia eta zabala giza genomen modifikazioak izan ditzakeen abantailen eta arriskuen inguruan”, adierazi zuten. Gurean, Elhuyar Zientziako Ana Galarragak ere jorratu zituen CRISPR/Cas teknologiak piztutako zalantza etikoak. Gene terapiaren ikerkuntza martxan jarri zenetik pil-pilean dagoen eztabaida da genomen edizioarena, baina CRISPR/Cas9 sistemaren sinpletasunak eta erabilerraztasunak esparru horri eman diezaiokeen bultzada ikusita funtsezkoa izango da ikerketa horien nondik norakoak arautuko dituen legedia osatzea.

Genomen edizioaz haratago, bada CRISPR/Cas teknologiari aplikazio praktikorik bilatu nahi dionik ere. Harvard Unibertsitateko (Cambridge, AEB) Geroge Church genetikari lehendik ere polemikoak (besteak beste, biologia sintetikoaren bidez mamutak edota neanderthal gizakiak berpizteko ideiak plazaratu ditu) CRISPR/Cas9 teknologia gene sintetiko higikorrak sortzeko erabili daitekeela proposatu du, zeintzuek gaitasuna izango zuten populazio naturaletan zehar hedatzeko. Teknologia hau malariaren bektore diren moskitoen aurka erabili nahiko luke Churchek. Bada, hala ere, halako entitate genetikoek ekosistemen orekan izan dezaketen ondorioen inguruko kezka eta beldur anitz. Churchen beste ideia polemikoetako bat da CRISPR/Cas9 bidez zerrietako erretrobirusak erasotzea zerrien organoak gizakietara transplantatu ahal izateko. Ikerketak martxan dira, baita ere, CRISPR/Cas bidez denge eta zika birusen bektorea erasateko.

Santa Polako gatzagetatik Nobel Sarira … ala ez?

Esanak esan eta dilemak dilema, Doudna eta Charpentierek deskribatutako CRISPR/Cas9 sistema iraultza ekartzen ari da biologia molekularrera eta CRISPR fenomeno biral bilakatu da. Horren isla da Pubmed artikulu zientifikoen bilatzailean eta Google-en “CRISPR” bilaketek izan duten bilakaera (4. Irudia). Sarreran aipa bezala, Doudna eta Charpentier Nobel Sarietarako hautagai izan daitezkeenaren zurrumurrua ere zabaldu da.

4. Irudia: Pubmed eta Google bilatzaileetan “CRISPR” bilaketek izandako bilakaera, 2005tik hona.

Baina oro ez da urre Doudna eta Charpentierentzat (5. Irudia) eta CRISPR/Cas teknologiak etorkizunean izan dezakeen inpaktua ikusita, Broad Institutuko (Cambridge, AEB) Feng Zhang ikertzaileak CRISPR/Cas9 teknologiaren patentea eskuratzeko ordagoa jo die. Zhangen aburuz, CRISPR/Cas9 sistema prozesu natural bat da eta patente batek, definizioz, ezin du prozesu natural bat bere horretan babestu. Horren ordez, Zhangek bere laborategiak garatu duen CRISPR/Cas9 sistema patentatu nahi du, zeinak badituen giza zeluletara egokitzeko hainbat eraldaketa. Doudnaren erakundea den Berkeley – Kaliforniako Unibertsitateak (AEB) patentearen eskaerarako lanak lehenago hasi bazituen ere, Broad Institutuak azkarrago jaso zuen behin-behineko patentea. Berkeleyk, nola ez, errekurtsoa altxa du erabaki horren aurka. Erabat gaiztotu da giroa bi erakundeen artean eta Broad Institutuaren patente eskaera azkarrago landu eta ebatz zedin diru-ordainketa ilunak egin zirela ere salatu da. Afera Nobel Sarien atarian leherturik, badirudi Suediako Akademiak zuhur jokatu nahi izan duela eta ez duela, oraingoz, eztabaida baldintzatuko zukeen erabakirik eman nahi izan.

5. Irudia: Doudna (ezk.) eta Charpentier (esk.), 2015eko Breakthrough Sarietan.

 

CRISPR/Cas9 teknologiak biomedikuntzaren historian inoiz mugitu den diru-poltsarik oparoena ekarriko dio patentea eskuratzen duenari. Bada baieztatzen duenik CRISPR/Cas teknologiak 80.eko hamarkadan PCR teknika izan zenaren pareko iraultza ekarriko duela. Kasualitatea ala ez, PCR teknika garatu zenean ere sekulako kalapita sortu zen patentea eskuratu nahi izan zuten hainbat erakunde eta zientzilariren artean. Santa Polako gatzagetan hasi zen Nobel Sarirako bide arrakastatsua, oraingoz bederen, patente-borrokaren lokatzetan trabatzen eta narrasten ari da. Gainera, litekeena da gatazka honek CRISPR/Cas teknologia oinarri hartuta sor daitezkeen aplikazioen garapena oztopatzea. Ez dadila eten, gutxienez, mundu osoko laborategiek genomen edizioarekin teknologia iraultzaile honi atera diezaioketen etekina.

Bibliografia

  1. F. J. Mojica, G. Juez, F. Rodríguez-Valera, Transcription at different salinities of http://gpsemirates.com/graduate-thesis-paper-to-purchase/ Graduate Thesis Paper To Purchase Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. get Mol. Microbiol. 9, 613–621 (1993).
  2. Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata, Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in http://ducasco.gr/custom-writtings-com/ Escherichia coli , and identification of the gene product. http://www.jsira.com/college-students-need-help-on-essays-companies-us.html college students need help on essays companies us J. Bacteriol. http://yellowsubmarina.com/the-color-purple-essay/ 169, 5429–33 (1987).
  3. F. J. M. Mojica, C. Díez-Villaseñor, J. García-Martínez, E. Soria, Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. write my business report J. Mol. Evol. Scientific Paper Writing Service 60, 174–182 (2005).
  4. R. Barrangou source url et al., CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes. http://www.frola.cz/keene-state-college-admission-essay/ Science. follow link 315, 1709–1712 (2007).
  5. E. S. Lander, The Heroes of CRISPR. Cell. http://www.ciplimemeprotezi.net/order-of-lab-report/ 164, 18–28 (2016).
  6. J. A. Doudna, E. Charpentier, The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. go here 346, 1258096–1258096 (2014).
  7. M. Jinek et al., A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337, 816–822 (2012).
  8. L. Cong et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. http://stjohns.lambdaphiepsilon.com/buy-microsoft-office-code/ 339, 819–23 (2013).
  9. M. Jinek et al., RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. source 2, e00471 (2013).
  10. P. Mali et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. get link 339, 823–6 (2013).
  11. P. Liang et al., CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. http://www.scarpetango.eu/customer-relationship-management-term-paper/ 6, 363–72 (2015).
  12. B. D. Baltimore et al., A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification. Science. college application essay writing help 348, 36–8 (2015).
  13. E. Lanphier, F. Urnov, S. E. Haecker, M. Werner, J. Smolenski, Don’t edit the human germ line. Nature. 519, 410–1 (2015).

Leave a comment

You are commenting as guest.

Irakurrienak

Erregistra zaitez

Erregistra zaitez!

· Parte hartu edukiak hornitzen eta eztabaidatzen 
 
· Igo itzazu argazkiak, bideoak, liburuak, estekak...